小鼠开窗手术与头环植入方法参考

清醒小鼠在体双光子成像的第一步，往往是一台漂亮的开颅开窗手术（Cranial Window）与头环植入。窗口是否透亮、头环是否稳固，直接决定了后续成像的成败。本文以图文形式，完整梳理从术前准备到术后护理的操作流程，供科研工作者参考。

小鼠开窗手术流程示意

手术前准备（器械与耗材）

手术前准备的器械与耗材

手术具体步骤

步骤 1：固定已麻醉小鼠

• 将麻醉小鼠的牙齿扣到手术台麻醉面罩处。
• 使用耳杆固定小鼠头部，旋转不同方向的旋钮调节小鼠头部位置。
• 使用镊子检查头部固定情况，无明显移动即可进行下一步。

步骤 2：涂眼膏保护小鼠眼睛

• 给小鼠眼睛涂上红霉素眼膏，在后续步骤中保护小鼠眼睛。

步骤 3：小鼠毛发清理

• 使用眼科手术剪小心地将小鼠头顶的毛发剪掉，小心操作，避免剪到小鼠眼睛部位。

步骤 4：使用碘伏消毒

• 使用碘伏消毒液对小鼠头顶进行消毒。

步骤 5：剪开头皮，暴露颅骨

• 使用另一把干净的手术剪，配合镊子，先在头顶中间剪开一道口，然后向两侧往小鼠眼睛上方剪出一道弧线，暴露整个颅骨。
• 剪开头皮暴露颅骨后，观察颅骨位置是否相对水平，然后进行二次调节。

步骤 6：使用过氧化氢腐蚀骨膜

• 使用棉签沾上过氧化氢溶液，在小鼠颅骨上小心涂抹，等待 5–10 秒，然后使用生理盐水清洗多余的过氧化氢溶液。

步骤 7：去除骨膜

• 使用手术剪和镊子，将骨膜小心去除；接着使用镊子夹持棉花，清理颅骨表面，并使用洗耳球吹气对颅骨进行风干干燥。

步骤 8：使用颅骨钻开窗

• 开窗使用 0.5mm 的钻头，配合中间转速，开始打磨窗口位置。
• 先打磨出窗口轮廓，轮廓大小略小于玻片直径即可，磨出轮廓后一圈圈加深轮廓。
• 打磨过程需要保持专注，可以两只手操作，保持动作稳定，并根据实际情况，适时用洗耳球吹走骨屑，同时磨骨过程中需要用生理盐水润湿窗口，防止打磨温度过高。
• 当使用钻头轻轻按压窗口颅骨观察有较大松动时，停止打磨，可以准备下一步。

步骤 9：颅骨敲除

• 使用生理盐水沾湿棉花，清理颅骨骨屑，并润湿窗口。
• 然后用干棉花擦干生理盐水，并且使用洗耳球再次吹干颅骨表面。
• 使用镊子沿着窗口打磨好的轮廓，轻轻撬起，慢慢掀开窗口的颅骨并取走。
• 使用止血海绵放在窗口上止血，时刻观察出血情况，同时清理好颅骨表面。当窗口血管不再渗血，即可进行下一步。

步骤 10：使用粘结剂覆盖颅骨

• 将 3M 粘结剂均匀涂在小鼠颅骨表面，注意需要覆盖完全，粘结剂作为底胶，使颅骨与树脂粘结更牢固。
• 然后使用蓝光固化灯照射 20 秒，使粘结剂完全固化，再进行下一步操作。

步骤 11：窗口玻片固定

• 首先在窗口四周（稍大于玻片直径的轮廓），轻轻涂上适量的 3M 流动树脂，过多的树脂有可能渗入窗口，造成手术失败。
• 将玻片放置在窗口上，并调整好位置，使用镊子轻轻按压定位。
• 然后用蓝光固化灯照射 3M 流动树脂 20 秒，初步固定玻片位置。
• 接着在玻片表面四周，覆盖一层 3M 流动树脂，上下两层树脂夹住玻片，使用蓝光固化灯照射 20 秒，使之完全固化，完成窗口玻片的固定。

步骤 12：头环固定

• 首先在干燥的颅骨表面，使用 3M 流动树脂完全覆盖颅骨表面。
• 使用镊子将头环放置到 3M 流动树脂上，头环需要注意 4 个缺口方向，同时要将头环底面尽量调整到与窗口玻片平行，否则可能影响显微镜观察的成像效果。
• 确定头环最终位置后，使用蓝光固化灯照射 3M 流动树脂 20 秒，使其完全固化。
• 在头环上方和四周涂上一层 3M 流动树脂，并且使用蓝光固化灯照射 20 秒，加固头环的固定；最后，取下固定的小鼠，完成整个手术。

附：小鼠手术防感染措施及术后护理

1. 保证实验环境相对独立封闭。
2. 手术器械消毒。
3. 使用无菌棉签、无菌生理盐水。
4. 玻片、头环要超声清洗后泡在酒精里。
5. 开窗后注射酮洛芬和庆大霉素抗炎。
6. 术后每天照紫外灯消毒。

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