小鼠開窗手術與頭環植入方法參考

清醒小鼠在體雙光子成像的第一步，往往是一台漂亮的開顱開窗手術（Cranial Window）與頭環植入。窗口是否透亮、頭環是否穩固，直接決定了後續成像的成敗。本文以圖文形式，完整梳理從術前準備到術後護理的操作流程，供科研工作者參考。

小鼠開窗手術流程示意

手術前準備（器械與耗材）

手術前準備的器械與耗材

手術具體步驟

步驟 1：固定已麻醉小鼠

• 將麻醉小鼠的牙齒扣到手術檯麻醉面罩處。
• 使用耳桿固定小鼠頭部，旋轉不同方向的旋鈕調節小鼠頭部位置。
• 使用鑷子檢查頭部固定情況，無明顯移動即可進行下一步。

步驟 2：塗眼膏保護小鼠眼睛

• 給小鼠眼睛塗上紅黴素眼膏，在後續步驟中保護小鼠眼睛。

步驟 3：小鼠毛髮清理

• 使用眼科手術剪小心地將小鼠頭頂的毛髮剪掉，小心操作，避免剪到小鼠眼睛部位。

步驟 4：使用碘伏消毒

• 使用碘伏消毒液對小鼠頭頂進行消毒。

步驟 5：剪開頭皮，暴露顱骨

• 使用另一把乾淨的手術剪，配合鑷子，先在頭頂中間剪開一道口，然後向兩側往小鼠眼睛上方剪出一道弧線，暴露整個顱骨。
• 剪開頭皮暴露顱骨後，觀察顱骨位置是否相對水平，然後進行二次調節。

步驟 6：使用過氧化氫腐蝕骨膜

• 使用棉棒沾上過氧化氫溶液，在小鼠顱骨上小心塗抹，等待 5–10 秒，然後使用生理食鹽水清洗多餘的過氧化氫溶液。

步驟 7：去除骨膜

• 使用手術剪和鑷子，將骨膜小心去除；接著使用鑷子夾持棉花，清理顱骨表面，並使用洗耳球吹氣對顱骨進行風乾乾燥。

步驟 8：使用顱骨鑽開窗

• 開窗使用 0.5mm 的鑽頭，配合中間轉速，開始打磨窗口位置。
• 先打磨出窗口輪廓，輪廓大小略小於玻片直徑即可，磨出輪廓後一圈圈加深輪廓。
• 打磨過程需要保持專注，可以兩隻手操作，保持動作穩定，並根據實際情況，適時用洗耳球吹走骨屑，同時磨骨過程中需要用生理食鹽水潤濕窗口，防止打磨溫度過高。
• 當使用鑽頭輕輕按壓窗口顱骨觀察有較大鬆動時，停止打磨，可以準備下一步。

步驟 9：顱骨敲除

• 使用生理食鹽水沾濕棉花，清理顱骨骨屑，並潤濕窗口。
• 然後用乾棉花擦乾生理食鹽水，並且使用洗耳球再次吹乾顱骨表面。
• 使用鑷子沿著窗口打磨好的輪廓，輕輕撬起，慢慢掀開窗口的顱骨並取走。
• 使用止血海綿放在窗口上止血，時刻觀察出血情況，同時清理好顱骨表面。當窗口血管不再滲血，即可進行下一步。

步驟 10：使用黏結劑覆蓋顱骨

• 將 3M 黏結劑均勻塗在小鼠顱骨表面，注意需要覆蓋完全，黏結劑作為底膠，使顱骨與樹脂黏結更牢固。
• 然後使用藍光固化燈照射 20 秒，使黏結劑完全固化，再進行下一步操作。

步驟 11：窗口玻片固定

• 首先在窗口四周（稍大於玻片直徑的輪廓），輕輕塗上適量的 3M 流動樹脂，過多的樹脂有可能滲入窗口，造成手術失敗。
• 將玻片放置在窗口上，並調整好位置，使用鑷子輕輕按壓定位。
• 然後用藍光固化燈照射 3M 流動樹脂 20 秒，初步固定玻片位置。
• 接著在玻片表面四周，覆蓋一層 3M 流動樹脂，上下兩層樹脂夾住玻片，使用藍光固化燈照射 20 秒，使之完全固化，完成窗口玻片的固定。

步驟 12：頭環固定

• 首先在乾燥的顱骨表面，使用 3M 流動樹脂完全覆蓋顱骨表面。
• 使用鑷子將頭環放置到 3M 流動樹脂上，頭環需要注意 4 個缺口方向，同時要將頭環底面盡量調整到與窗口玻片平行，否則可能影響顯微鏡觀察的成像效果。
• 確定頭環最終位置後，使用藍光固化燈照射 3M 流動樹脂 20 秒，使其完全固化。
• 在頭環上方和四周塗上一層 3M 流動樹脂，並且使用藍光固化燈照射 20 秒，加固頭環的固定；最後，取下固定的小鼠，完成整個手術。

附：小鼠手術防感染措施及術後護理

1. 保證實驗環境相對獨立封閉。
2. 手術器械消毒。
3. 使用無菌棉棒、無菌生理食鹽水。
4. 玻片、頭環要超音波清洗後泡在酒精裡。
5. 開窗後注射酮洛芬和慶大黴素抗炎。
6. 術後每天照紫外燈消毒。

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